Begini Loh Mekanisme Kerja High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

 

Begini Loh Mekanisme Kerja High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan. Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam. Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah. Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom.

Setelah komponen terelusi dari kolom, komponen tersebut dapat dianalisis dengan menggunakan detektor atau dapat dikumpulkan untuk analisis lebih lanjut. Beberapa alat-alat analitik dapat digabungkan dengan metode pemisahan untuk analisis secara on-line (on-line analysis) seperti: penggabungan kromatografi gas (gas chromatography) dan kromatografi cair (liquid chromatography) dengan mass spectrometry (GC-MS dan LC-MS), Fourier-transform infrared spectroscopy (GC-FTIR), dan diode-array UV-VIS (HPLC-UV-VIS).

Pengertian HPLC

Kromatografi cair berperforma tinggi ((Inggris): high performance liquid chromatography, HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. Seperti teknik kromatografi pada umumnya, HPLC berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padattertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fase cair dan zat padatnya merupakan fase diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karana setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fase diam tertentu dan fase gerak tertentu. Dengan bantuan detektor serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram. Kromatorgram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.

Prinsip Kerja HPLC

Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah.

Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alkohol < golongan asam.

HPLC dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada proses kualitatif cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time (RT). Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya adalah sebagai peak milik analat. Selain melihat RT hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.

Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen yang dianalisis di dalam sampel.  Yang berperan dalam proses separasi pada system HPLC adalah kolom. Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18 yang dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya. Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang khusus digunakan untuk analisa karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.

Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya adalah proses identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample.

Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja.

PREPARASI SAMPEL

Sampel harus dalam bentuk larutan.   Untuk skala analisis sampel dalam μL, konsentrasi sampel yang diinjeksikan tidak boleh terlalu pekat karena dapat menyumbat kolom. Konsentrasi maksimal adalah sekitar 40 ppm.

PREPARASI FASA GERAK

 Fasa gerak (eluen) yang digunakan harus dalam kualitas p.a ataupun grade HPLC. Untuk air, digunakan akuabidest.

 Sebelum digunakan, eluen harus disaring dengan millipore kemudian diawagaskan (didigest) dengan sonikator sekitar 30 menit untuk menghilangkan udara terlarut.

Eluen harus dimasukkan ke dalam tabung eluen sebelum alat dinyalakan, untuk menghindari adanya gelembung pada selang penghubung.

Tabung eluen yang sudah diisi harus diberi label sesuai dengan eluen yang digunakan.

PENYALAAN ALAT

•           Sebelum alat dinyalakan, pastikan dalam slang penghubung antara tabung eluen dengan pompa tidak terdapat gelembung udara. Jika terdapat gelembung, buka penutup pompa kemudian buka katup slang di ujung pompa dan sedot secepatnya gelembung tersebut dari slang dengan alat penyedot gelembung yang tersedia kemudian tutup katup dan tutup pompa kembali seperti semula.

•           Hubungkan kabel alat ke sumber listrik (saklar).

•           Nyalakan tombol paling bawah alat HPLC (tombol detektor).

•           Nyalakan tombol tengah HPLC (kolom)

•           Nyalakan tombol paling atas dari HPLC (pompa)

•           Nyalakan tombol power CPU kemudian tombol power pada monitor.

MEMBUKA WINDOWS NT DAN AGILENT CHEMSTATION

•           Setelah alat dan komputer menyala, pada layar komputer akan muncul tampilan :

Windows NT workstation version 4.00

Windows NT workstation version 4.00(VGA mode)

PENYETABILAN ALAT SEBELUM INJEKSI

Sebelum injeksi, alat yang baru saja dinyalakan harus distabilkan terlebih dahulu untuk menjaga alat tersebut agar tetap awet, selain itu penyetabilan juga dimaksudkan agar alat benar-benar siap injeksi sehingga kromatogram yang dihasilkan akan bagus.

Untuk menstabilkan alat, setelah masuk ke menu Online Agilent Chemstation, klik menu Run Control. Kemudian :

• Klik pada gambar pompa, klik control, klik on.

• Klik menu Instrument, klik pada set up pump

>set gradient fasa gerak

>set laju alir

>set waktu run dan post run

catatan : dalam masa penyetabilan, setting laju alir cukup sekitar 0,1 uL/menit untuk menghemat eluen.

• Klik pada kolom, klik control, klik on.

• Klik gambar DAD signals,klik control, klik on (pada UV atau Visible), tergantung sample yang akan diinjeksikan.

• Klik menu Instrument, klik set up colomn untuk mengatur kondisi kolom yang diinginkan.

• Klik menu Instrument, klik Set Up DAD Signals untuk mengatur panjang gelombang detektor yang diinginkan. Masukkan panjang gelombang pilihan disertai dengan tanda X.

• Biarkan alat running dalam laju alir sekitar 0,1 uL/menit selama kurang lebih 45-60 menit untuk menstabilkan.

• Setelah waktu tersebut, naikkan perlahan laju alir sampai laju alir yang diinginkan (jangan langsung pada laju alir yang diinginkan) INGAT ! Naikkan Perlahan....Agar tekanan pompa stabil...!

PERSIAPAN INJEKSI

INGAT.....: TANDA MERAH = ALAT TIDAK SIAP

TANDA BIRU = ALAT SEDANG RUNNING

TANDA HIJAU = ALAT SIAP DIINJEKSI

• Nyalakan detektor DAD dan kolom (seperti tadi)

• Perbesar tampilan kromatogram di layar agar terlihat jelas

•           Perhatikan kromatogram sampai terbentuk baseline. Untuk mendekatkan line dengan jangkauan mata, tekan ADJUST, untuk membuat baseline pada skala nol tekan BALANCE.

•           Setelah baseline yang diinginkan terbentuk, klik menu RUNCONTROL, klik SAMPLE INFO untuk memasukkan data file-folder berikut keterangan sampel.

•           Lihat tanda warna, jika sudah hijau (READY) berarti siap injeksi.

•           Sebaiknya kolom dicuci dulu dengan cara menginjeksikan fasa gerak utama ke kolom. Begitu pula setiap setelah injek satu sampel dan akan ganti dengan sampel lain, kolom harus dicuci dahulu (sekitar 20 menit), pencucian masukkan ke dalam file CUCI. 

CARA INJEKSI

•           Ambil alat injek (syringe).

•           Bilas syringe dengan zat yang sama dengan fasa gerak utama (misalnya metanol)

•           Kemudian bilas syringe dengan sampel

•           Isi syringe dengan sampel, INGAT dalam syringe yang sudah diisi tersebut tidak boleh ada ruang kosong oleh udara yang terperangkap atau gelembung udara

•           Volume injeksi maksimum adalah 20 uL karena pada injektor standar terpasang loop 20 uL

•           Masukkan jarum syringe ke injektor, buka injektor (load, putar ke atas), injek cepat, tutup injektor (inject, putar ke bawah), baru tarik jarum syringe dari injektor. Di layar segera akan ada tanda biru...Run in progress data aquasition.........

•           Setelah waktu running yang diinginkan habis, tekan tombol F8 untuk menghentikan runing. Maka komputer akan segera menghitung tinggi puncak-puncak yang keluar berikut luas puncaknya. Pada proses ini di layar akan muncul tampilan biru dengan tulisan...”Run in Progress Data Analysis”.

•           Setelah di layar muncul kembali tampilan “Ready” (hijau), maka pekerjaan selanjutnya dapat dilakukan. Untuk menginjeksikan kembali sampel lain sebaiknya kolom dicuci terlebih dahulu. Masukkan running cuci kolom ke dalam file cuci.

PRINT OUT KROMATOGRAM

• Untuk melihat hasil analisis yang telah dilakukan komputer terhadap sampel yang telah kita injeksikan, klik menu VIEW, Klik DATA ANALYSIS.

• Kemudian Klik menu FILE dan klik LOAD SIGNALS untuk memilih file mana yang akan dibuka beserta panjang gelombang deteksi yang diinginkan. Segera akan keluar tampilan kromatogram yang dipanggil.

• Untuk menampilkan waktu retensi setiap puncak pada kromatogram yang dipanggil tersebut, Klik menu INTEGRATION lalu klik INTEGRATE. Maka segera akan muncul nilai retensi dari setiap puncak. Karena detektor yang ada yaitu DAD (Diode Arays Detector) sangat sensitif, maka setiap puncak yang muncul, sekecil apapun akan dapat terintegrasi sehingga puncak-puncak ini harus dihapus retensinya, artinya yang kita tampilkan waktu retensinya hanya puncak-puncak yang besar dan yang kita perlukan saja. Untuk keperluan tersebut, klik menu FILE, klik DELETE PEAK sampai muncul tanda X merah. Atau dapat langsung klik di menu X merah yang biasanya ada di layar. Untuk menghapusnya, klik dengan X merah tersebut di tempat-tempat yang waktu retensinya tidak ingin ditampilkan.

• Untuk mendapatkan print out kromatogram, Klik menu REPORT, klik SPECIFY REPORT untuk mengatur tampilan kromatogram yang diinginkan. Setelah siap, klik PRINT REPORT lalu tunggu sebentar sampai komputer menampilkan print previewnya. Kemudian klik pada icons PRINT yang ada di bawah print preview kromatogram.

• Untuk kembali ke RUN CONTROL (misal akan injek baru), klik menu VIEW, klik METHOD AND RUN CONTROL.

Pilih menu yang pertama (Windows NT workstation version 4.00) secepatnya, kemudian tekan ENTER.

• Kemudian akan muncul menu Begin Log On, tekan Ctrl-Alt-Del.

• Setelah itu akan muncul menu PassWord, pada password ini tidak perlu diisi apa-apa, langsung klik OK. Perhatian...DILARANG MEMASANG PASSWORD PADA PENGOLAH DATA !

• Kemudian akan muncul menu Server NT...., klik No

• Selanjutnya akan sampai di menu utama MS-Windows NT, double klik pada menu Instrument 1 Online.

Catatan : Menu Instrument 1 Offline digunakan untuk keperluan pengolahan data tanpa penyalaan alat (yang dinyalakan hanya perangkat komputernya saja). Menu ini misalnya digunakan untuk print out kromatogram yang belum sempat dilakukan atau untuk melakukan print ulang kromatogram yang sudah ada.

•           Kemudian tunggu sampai masuk ke menu Online Agilent Chemstation.

Komponen-Komponen KCKT

Komponen-komponen penting dari KCKT dapat dilihat pada Diagram Blok KCKT berikut ini :

 

Begini Loh Mekanisme Kerja High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Pompa (Pump)

Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom. Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating),oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk, menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.

Injektor (injector)

Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang minimum dari material kolom. Ada dua model umum :

a. Stopped Flow

b. Solvent Flowing

Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :

a.   Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi

b.   Septum: Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60 -70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair.Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.

c.   Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuK ke dalam kolom. 

Kolom (Column)

Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :

a.   Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 -100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.

b.   Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25 -100 cm.

Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom tergantung pada model KCKT yang digunakan (Liquid Solid Chromatography, LSC; Liquid Liquid Chromatography, LLC; Ion Exchange Chromatography, IEC, Exclution Chromatography, EC) 

Detektor (Detector)

Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif).Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh.  

Detektor KCKT yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan range yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif jika dibandingkan dengan detektor UV. Detektor-detektor lainnya antara lain:

Detektor Fluorometer -Detektor Spektrofotometer Massa

Detektor lonisasi nyala -Detektor Refraksi lndeks

Detektor Elektrokimia -Detektor Reaksi Kimia

Elusi Gradien

Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama analisis kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi Gradien adalah mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada kolom. Dasar-dasar elusi gradien dijelaskan oleh Snyder.

Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan :

a. Total waktu analisis dapat direduksi

b. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah

c. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)

d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak

Gradien dapat dihentikan sejenak atau dilanjutkan. Optimasi Gradien dapat dipilih dengan cara trial and error. Tabel 3. 1. berikut ini menunjukkan kompatibilitas dari bermacam-macarn mode kromatografi cair dengan analisis gradien. Dalam praktek, gradien dapat diformasi sebelum dan sesudah pompa.

© 2004 Digitized by USU digital library 6

Tabel 3. 1 : Mode Kompatibilitas dengan Gradien Mode	Solven Gradien
Kromatografi Cair padat (LSC)	Ya
Kromatografi ekslusi	Tidak
Kromatografi Penukar Ion (IEC)	Ya
Kromatografi Cair Cair (LLC)	Tidak
Kromatografi Fasa Terikat (BPC)	Ya

Pengolahan Data (Data Handling)

Hasil dari pemisahan kromatografi biasanya ditampilkan dalam bentuk kromatogram pada rekorder. Suatu tipe Kromatogram dapat dilihat pada Gambar berikut ini

Dari Gambar waktu retensi dan volume retensi dapat diketahui /dihitung. Lni bisa digunakan untuk mengidentifikasi secara kualitatif suatu komponen, bila kondisi kerja dapat dikontrol. Lebar puncak dan tinggi puncak sebanding atau proporsional dengan konsentrasi dan dapat digunakan untuk memperoleh hasil secara kuantitatif.

Fasa gerak

Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak adalah salah satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada solven yang digunakan untuk KCKT, tetapi ada beberapa sifat umum yang sangat disukai, yaitu rasa gerak harus :

1. Murni, tidak terdapat kontaminan

2. Tdak bereaksi dengan wadah (packing)

3. Sesuai dengan defektor

4. Melarutkan sampel

5. Memiliki visikositas rendah

6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"

7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable price)

Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang karena prosedur pemumiannya kembali sangat membosankan dan mahal biayanya. Dari semua persyaratan di atas, persyaratan 1) s/d 4) merupakan yang sangat penting.

Pola Elusi (Mekanisme Pemisahan) Pada Hplc

Pada HPLC pemisahan terjadi di dalam kolom, sehingga mekanisme pemisahan atau pola elusinya seperti pada kromatografi kolom. Gambar di bawah menunjukkan profil konsentrasi komponen A dan B pada awal dan akhir elusi. Koefisien partisi A > B, oleh karena itu pada proses migrasi komponen A berada di belakang komponen B. Bersamaan dengan proses migrasi, terjadi pula efek pelebaran pada kedua pita yang mengurangi efisiensi pemisahan. Pelebaran pita tidak dapat dihilangkan secara total, namun dapat dikurangi sehingga pelebaran pita terjadi jauh lebih lambat daripada pemisahan pita. Dengan demikian pemisahan kedua komponen dapat terjadi secara sempurna pada panjang kolom yang sesuai.

Profil Konsentrasi Solut A dan B pada Jarak Migrasi yang Berbeda

Padatan pendukung pada kromatografi partisi disalut dengan fase diam cair, dan pemisahan senyawa campuran ditentukan oleh koefisien partisi masing-msing senyawa di antara kedua fase cair. Pada kedua fase yaitu fase gerak dan fase diam, salah satu diantaranya harus lebih polar dibanding yang lain. Bila fase diam lebih polar, disebut kromatografi partisi fase normal. Bila sebaliknya, disebut kromatografi partisi fase terbalik. Pada fase normal, senyawa polar lebih terbagi ke fase diam dan tertambat lebih lama dibanding senyawa nonpolar. Pada kromatografi partisi fase terbalik, terjadi hal yang sebaliknya.

Analisis Kualitatif

Proses terbawanya solut dari puncak kolom sampai akhir kolom disebut elusi. Apabila detektor ditempatkan pada ujung akhir kolom, maka akan diperoleh sinyal yang digambarkan sebagai fungsi waktu, yang disebut kromatogram. Kromatogram akan memperlihatkan bahwa setiap senyawa meninggalkan kolom sebagai puncak simetri, sehingga sinyal detektor yang tercatat berbentuk kurva Gauss pada waktu yang khas untuk setiap senyawa. Oleh karena itu, kromatogram dapat menunjukkan waktu yang diperlukan untuk elusi. Waktu yang menunjukkan puncak signal disebut waktu retensi (tR), yang tidak lain adalah waktu yang dibutuhkan analit mulai saat diinjeksikan hingga terelusi dan keluar dari kolom pada konsentrasi maksimumnya. Tiap senyawa memiliki waktu retensi yang spesifik pada kondisi tertentu, antara lain kondisi kolom, tekanan, suhu, laju aliran fase gerak, dll, sehingga dapat digunakan sebagai salah satu dasar untuk analisis kualitatif. Beberapa senyawa memiliki waktu retensi yang berdekatan, namun tiap senyawa hanya memiliki satu waktu retensi saja. Dengan membandingkan waktu retensi analit dengan waktu retensi senyawa baku maka analit dapat diidentifikasi. 

Analisis Kuantitatif

Analisis Kuantitatif Berdasarkan Tinggi Puncak

Tinggi puncak diperoleh dengan membuiat garis antara kedua dasar sisi puncak, dan mengukur tegak lurus dari garis tersebut hingga puncak kromatogram. Apabila variasi pada keadaan kolom tidak menyebabkan pelebaran puncak, dimana kromatogram yang diperoleh berupa pita yang sempit dan tajam, maka analisis kuantitatif lebih baik didasarkan pada tinggi puncak. Pengukuran ini dapat dilakukan dengan ketelitian tinggi, sehingga data yang diperoleh akan lebih akurat. Variabel yang perlu dikendalikan pada analisis ini adalah suhu dalam kolom, laju alir fase gerak, tekanan dalam kolom, dan kecepatan injeksi. Kesalahan relatif yang disebabkan oleh penginjeksian berkisar antara 5 – 10%.

Analisis Kuantitatif Berdasarkan Luas Puncak

Pengukuran dengan cara ini tidak dipengaruhi oleh pelebaran pita, oleh karena itu cara ini lebih disukai daripada pengukuran tinggi puncak. Pada umumnya, instrumen kromatografi dilengkapi dengan integrator yang memungkinkan pengukuran luas puncak secara lebih teliti. Bila tidak ada integrator maka pengukuran harus dilakukan secara manual. Konsentrasi dapat dihitung dengan persamaan:

Cx = Ax / Ap X Cp

Keterangan :

A = Peak area = Luas puncak

C = Konsentrasi

X = sampel

P = pembanding

Analisis Kuantitatif secara Kalibrasi dengan Standar

Metode untuk memperkirakan komposisi suatu campuran yang tidak diketahui adalah dengan membandingkan terhadap suatu seri larutan baku dengan berbagai konsentrasi. Setelah pembuatan kromatogram dari masing-masing larutan standar, kemudian dibuat kurva baku dengan tinggi puncak atau luas puncak sebagai fungsi konsentrasi. Sumber kesalahan utama pada metode ini terletak pada volume larutan yang diinjeksikan yang tidak reprodusibel.

Analisis Kuantitatif dengan Standar Internal

Pada metode ini dapat diperoleh ketelitian tertinggi pada analisis kuantitatif, karena variasi volume larutan yang diinjeksikan dapat dieliminasi. Pada metode ini sejumlah standar internal dimasukkan ke dalam tiap larutan standar dan larutan sampel. Analisis kuantitatif dilakukan dengan rasio luas atau tinggi puncak analit terhadap standar internal. Senyawa yang digunakan sebagai standar internal harus terpisah dari analit namun dekat dengan puncak analit.