Metode
yang umum digunakan dalam pengujian aktivitas antioksidan adalah diphenylpicrylhydrazil
(DPPH) free radical scavenging assay. Pada metode ini, larutan DPPH
yang berperan sebagai radikal bebas akan bereaksi dengan senyawa antioksidan
sehingga DPPH akan berubah
menjadi diphenilpycrilhydrazine yang bersifat non-radikal.
Peningkatan jumlah diphenilpycrilhydrazine akan ditandai dengan
berubahnya warna ungu menjadi warna kuning pucat yang dapat dideteksi pada
panjang gelombang 517 nm.
Karena adanya elektron yang tidak berpasangan, DPPH memberikan serapan
kuat pada 517 nm. Ketika elektronnya menjadi berpasangan oleh keberadaan
penangkap radikal bebas, maka absorbansinya menurun secara stokiometri
sesuai jumlah elektron yang diambil. Keberadaan senyawa antioksidan
dapat mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning. Perubahan absorbansi akibat
reaksi ini telah digunakan secara luas untuk menguji kemampuan beberapa
molekul sebagai penangkap radikal bebas.
Secara umum hasil dari metode DPPH diinterpretasikan dalam
parameter IC50 (Inhibition Concentration) atau EC50
(Effective Concentration 50). IC50 atau EC50
didefinisikan sebagai konsentrasi larutan substrat atau sampel yang akan
menyebabkan tereduksi aktivitas DPPH sebesar 50%. Semakin besar aktivitas
antioksidan maka nilai IC50 atau EC50 akan semakin keci.
Vitamin C dapat digunakan sebagai antioksidan pembanding
dalam uji DPPH. Dalam hal ini, Vitamin C bersifat sebagai antioksidan primer. Vitamin C dapat dengan cepat
mendonorkan atom hidrogen ke radikal lipid untuk membentuk radikal bebas
askorbil yang stabil. Adapun
mekanisme stabilisasi radikal bebas oleh vitamin C dapat dilihat pada Gambar berikut.
Gambar. Stabilisasi radikal bebas oleh Vitamin C
